基底前脑胆碱能神经元在睡眠觉醒中的作用研究

【摘要】背景和目的：睡眠与觉醒是脑的高级功能,是人体所必需的生理节律性活动。睡眠障碍或者睡眠剥夺会引起负面情绪,甚至引发重大神经精神疾病。啮齿类动物的睡眠觉醒节律是白天睡眠居多,为非活动期(inactiveperiod),晚上较为活跃,为活动期(activeperiod)。根据脑电(electroencephalographic,EEG)和肌电(electromyographic,EMG)记录可以将动物的睡眠状态分为慢波睡眠(slow-wavesleep,SWS)和快速动眼(rapideyemovement,REM)睡眠。脑内和睡眠觉醒相关的核团有很多,基底前脑(basalforebrain,BF)是位于端脑和间脑腹侧的一些结构,包括无名质(substantiainnominata,SI)、斜角带核(nucleusofthehorizontallimbofthediagonalband,HDB)、大细胞视前核(magnocellularpreopticnucleus,MCPO)等,它们向皮层发出的胆碱能投射形成了皮层胆碱能的主要来源。BF脑区有5%的胆碱能神经元、35%的GABA能神经元和55%的谷氨酸能神经元。先前有研究认为BF内的胆碱能神经元与清醒或REM睡眠时的皮层活跃度增高有关。由于研究手段的限制,过去的研究一般使用电刺激和给药两种方法来激活或者毁损BF胆碱能系统。电刺激的特异性很差,无法做到只激活胆碱能神经元而不激活其它类型的神经元。在研究大小鼠的睡眠与觉醒时,由于大小鼠的睡眠觉醒状态转换很快(与人类很不同),一个睡眠时相或觉醒状态的维持往往只有几分钟,故用药物注射无法研究动物睡眠觉醒状态的即时改变。所以传统的研究手段对于研究BF内的只占5%的胆碱能神经元在调节睡眠觉醒的中的确切作用和机制存在较大的争议。光遗传学(optogenetics)采用基因操作技术将光敏感基因,比如channelrhodopsin2(ChR2)、archearhodopsin(Arch)等转入到神经系统特定类型的细胞中进行离子通道的表达。光感离子通道在不同波长的光照刺激下会分别对阳离子或者阴离子的通过产生选择性,从而造成细胞膜两边的膜电位发生变化,达到对细胞选择性地兴奋或者抑制的目的。光遗传技术具有独特的高时空分辨率和细胞类型特异性,克服了传统手段控制细胞或有机体活动的许多缺点,故能对神经元进行非侵入式的精准定位刺激操作。为了更加准确的研究BF的胆碱能神经元在自然觉醒睡眠中的作用,我们把光遗传学技术与传统的电生理技术相结合,选择性激活ChAT-ChR2-EYFP转基因小鼠(ChAT-ChR2mice)的胆碱能神经元以及抑制ChAT-Arch-GFP小鼠(ChAT-Archmice)的胆碱能神经元,特异地改变胆碱能神经元的活动,从而研究BF的胆碱能神经元对睡眠觉醒活动的快速调节作用以及对睡眠节律和稳态的影响。实验方法：实验研究对象主要为ChAT-ChR2和ChAT-Arch小鼠。ChAT-Arch小鼠是通过ROSA-Arch-GFP小鼠与ChAT-Cre小鼠杂交获得,并进行PCR基因型鉴定。离体电生理实验采用出生后4周的ChAT-Arch小鼠,断头取脑之后进行300μm的冠状切片然后全细胞记录,电压钳模式记录细胞膜电流反应,电流钳模式记录细胞膜电位反应。在体实验采用25～30g雄性小鼠,1%的戊巴比妥钠(100mg/kg)腹腔注射,并在脑立体定位仪上固定。将光纤套管插入到BF,光纤刺激位置为：anteroposterior(AP):-0.7mm,mediolateral(ML):1.6mm,dorsoventral(DV):4.5mm,同时将EEG/电极植入到小鼠的前额叶皮层对应的颅骨表面,电极记录位置为：AP:+2.0mm,ML:1.0mm;将EMG电极插入到小鼠颈部肌肉内。动物恢复箱内恢复1周后转移至记录箱内,连接数据记录线记录EEG/EMG,用刺激器控制激光器产生光刺激。采用473nm的蓝光刺激ChAT-ChR2小鼠,589nm的黄光刺激ChAT-Arch小鼠,光纤尖部所测得的光功率为0.5-1.5mW。离体脑片实验中黄光光照为持续脉冲刺激或20ms脉冲刺激,刺激频率为20Hz和连续刺激,刺激持续时间30s或60s。在体急性实验中蓝光刺激采用20Hz/30ms的刺激参数,刺激时间为15s；黄光刺激采用30s的持续刺激。慢性实验中黄光刺激采用的参数为连续刺激60s,每两分钟刺激一次,持续6h。记录完后心脏灌流取出大脑组织,冠状切片获得脑片组织进行位置鉴定以及免疫组织化学反应。结果：1、免疫组化实验显示在BF97.6±0.9%(n=4mice)的ChR2-EYFP以及92.1±1.2%(n=5mice)的Arch-GFP阳性神经元是ChAT免疫组化阳性神经元。2、离体脑片实验中,在ChAT-Arch小鼠的BF给予20Hz/20ms或者持续黄光刺激30s以及60s都可以有效可逆的抑制胆碱能神经元的放电。3、非活动期的ChAT-ChR2小鼠进入SWS时,在BF给予15s的20Hz/30ms蓝光刺激可以明显引起小鼠由SWS向清醒的转化(66.1±6.2%),而在野生型(WT)小鼠中SWS向清醒的转化概率只有17.9±0.3%(P＜0.01,n=60stimulationsin3mice).活动期刺激引起的效应与非活动期类似。4、非活动期的ChAT-ChR2小鼠进入SWS时,在BF给予15s的20Hz/30ms蓝光刺激也可以显著增加由SWS向REM睡眠的转化(19.5±3.3%),而在WT小鼠中SWS向REM睡眠的转化概率只有2.9±2.9%(P＜0.05,n=60stimuIationsin3mice).活动期刺激引起的效应与非活动期类似。5、在非活动期,ChAT-Arch小鼠进入SWS时,30s的双侧黄光抑制BF胆碱神经元明显降低了动物由SWS向清醒的转化概率(11.7±2.1%),而在对照组小鼠以及单侧黄光抑制BF胆碱能神经元的ChAT-Arch,其SWS向清醒的转化概率分别为33.0±2.5%和27.5±3.1％(P＜0.01,n=60stimulationsin3mice)。在动物清醒时给予BF双侧黄光抑制,由清醒向SWS的转化在抑制之后并没有明显的改变。活动期抑制引起的效应与非活动期类似。6、在非活动期,ChAT-Arch小鼠进入SWS时,给予双侧黄光抑制可以延长单个SWS的持续时间,由73.5±5.3s增加到105±10.5s(P＜0.05,n=75stimulationsin3mice),在活动期抑制引起的效应与非活动期类似。在非活动期或活动期,当动物处于REM睡眠时,给予双侧或单侧黄光抑制并不影响单个REM睡眠的持续时间。7、在非活动期(13：00-19：00)和活动期(19：00-1：00)分别对ChAT-Arch小鼠的双侧BF胆碱能神经元进行6h的长时程黄光抑制,引起小鼠SWS的增加(P<0.05,n=3mice),清醒时间的减少(P<0.05,n=3mice),但不影响REM睡眠的时间。在6h长时程黄光抑制结束之后,清醒时间代偿性增加以及SWS代偿性减少。但是与抑制前相比较,抑制后24h内总的觉醒和睡眠时间没有改变。结论：激活BF的胆碱能神经元能充分引起觉醒或REM睡眠,但BF的胆碱能神经元对于维持清醒不是必要的。BF胆碱能系统作为脑内一个重要的促觉醒核团,它功能状态的改变不影响动物整体睡眠节律及稳态的平衡。
【作者】石玉锋；
【导师】虞燕琴；
【作者基本信息】浙江大学，生理学，2014，硕士
【关键词】基底前脑；乙酰胆碱；睡眠与觉醒；光遗传学；光敏感通道；脑电与肌电；

【参考文献】
[1]高凤华.政府规制下的企业低碳物流技术应用博弈研究[D].山东大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[2]王伟.基于模糊综合评判的网络状态认知模型的研究[D].河南科技大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[3]罗林波,王存军,田永常.高校科技管理信息化建设的思路与实践[J].科技情报开发与经济,2005,21:266-268.
[4]许桂红.20世纪美国学界的女真研究[D].黑龙江大学,史学理论及史学史,2013,硕士.
[5]魏思博.我国商业健康保险发展对策研究[D].河北经贸大学,金融学,2012,硕士.
[6]孙涛.基于物联网技术货运车辆管理与安防系统研制[D].西安科技大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[7]张野,袁振洲.信号交叉口左转专用可变车道设置研究[J].交通信息与安全,2014,04:26-30.
[8]钟春.阵风风谱的风洞模拟研究[D].西安建筑科技大学,供热、通风与空调工程,2004,硕士.
[9]许丹丹.主动性人格、组织创新氛围对酒店员工创新行为的影响[D].华侨大学,旅游管理,2013,硕士.
[10]王晓蕾.商业银行业务流程再造机理研究[D].武汉理工大学,会计学,2003,硕士.
[11]刘清林,何樵登.Tau—p变换与Tau—p域偏移[J].石油地球物理勘探,1988,02:171-187+256.
[12]宫媛娜.触屏手机尺寸与用户手型尺寸匹配性的工效学研究[D].浙江理工大学,应用心理学,2013,硕士.
[13]尹俊岭.BI解决管理决策需求[J].信息系统工程,2004,06:58.
[14]于宁.烷基糖苷的合成及物化性能分析[D].大连理工大学,应用化学,2004,硕士.
[15]谢德昭.基于VxWorks嵌入式PECVD设备系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[16]肖瑞.石墨烯及其Al-20Si基复合材料的制备与性能研究[D].哈尔滨工业大学,材料学,2014,硕士.
[17]孙金娥.骨折内固定用镁基复合材料研究及其生物相容性评价[D].天津理工大学,材料学,2013,硕士.
[18]陈婧.基于调节聚集与特征框架的调节匹配对建言的影响机制[D].苏州大学,应用心理学,2013,硕士.
[19]吴江.信息技术企业应用的作用机制研究和效益评价指标体系设计[D].重庆大学,2002.
[20]郭成林.邯郸市学前教育信息管理系统的设计与实现[D].山东大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[21]吕箭箭.当代西方社会思潮对我国青年价值观的影响研究[D].吉林农业大学,思想政治教育,2012,硕士.
[22]李福梅.河井双灌区规划方案探讨[J].水利规划与设计.2004(S2)
[23]赵敬.复杂网络上的疾病传播与抑制策略研究[D].天津理工大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[24]方建春,宋玉华.我国在稀有金属出口市场的市场势力研究——以钨矿、稀土金属为例[J].国际贸易问题,2011,01:3-11.
[25]王爽.S市城建局公务员绩效考核指标体系研究[D].大连理工大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[26]郭水良,方芳,黄华,强胜.外来入侵植物北美车前繁殖及光合生理生态学研究[J].植物生态学报,2004,06:787-793.
[27]朱增旭.P2P视频流媒体播放系统的设计与应用[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[28]郭振业.单层培养与海藻酸钠立体培养兔膝关节软骨细胞力学特性比较的研究[D].山西医科大学,骨外科学,2013,硕士.
[29]赵南.炎症相关基因多态性与中国汉族人群缺血性脑卒中的关系研究[D].哈尔滨医科大学,流行病与卫生统计学,2012,硕士.
[30]丁泽琴.茄子功能性雄性不育的细胞学及内源激素变化研究[D].西南大学,植物学,2014,硕士.
[31]张福禄,杨春旭,高和.混铁水车及混铁炉的发展趋势[J].一重技术.1998(04)
[32]郭礼森.石墨烯/氧化锌复合材料的制备及其场发射性能研究[D].吉林大学,材料学,2013,硕士.
[33]张楠,吕岩,吴枫,尹宝才.基于方向提升小波变换的多描述图像编码[J].自动化学报,2007,06:567-576.
[34]张银霞.商业综合体内部交通空间的功能复合化及优化策略研究[D].长安大学,建筑设计及其理论,2014,硕士.
[35]李响,谭南林,李国正,张驰.基于Zernike矩的人眼定位与状态识别[J].电子测量与仪器学报,2015,03:390-398.
[36]吕静.亚胺类白藜芦醇类似物的合成及活性研究[D].浙江大学,化学,2013,硕士.
[37]何洋.基于刚性散体的抛光头柔度控制与抛光技术研究[D].浙江工业大学,2008.
[38]张耀.中功率X波段栅控行波管发射机研制[D].西安电子科技大学,电子与通信工程,2011,硕士.
[39]彭凯.基于Nios Ⅱ软核的多功能定时控制的设计与实现[D].西安电子科技大学,信号与信息处理,2012,硕士.
[40]王邱.制造业上市公司信贷融资能力影响因素实证研究[J].财会通讯,2014,24:86-88.
[41]俞昌朝.多壁碳纳米管/聚酰胺复合膜的制备与表征[D].浙江工业大学,2013.
[42]李娜.闽产风藤品质评价及其药效学研究[D].福建中医药大学,中药学,2014,硕士.
[43]李超.单、双侧入路PKP治疗骨质疏松性椎体压缩骨折的疗效比较[D].湖北中医药大学,中医骨伤科学（专业学位）,2013,硕士.
[44]李冰侠.农村种粮大户综合服务网络管理平台的实现[D].吉林大学,软件工程,2014,硕士.
[45]张超凤.超声辅助电解加工机理及试验研究[D].扬州大学,机械制造及其自动化,2012,硕士.
[46]任艳霞.电力电缆故障诊断与监测[D].北京交通大学,2008.
[47]宋威.在碳酸氢盐活化过氧化氢的条件下负载型钴催化剂催化苯酚降解的研究[D].华中科技大学,有机化学,2013,硕士.
[48]姚芸.尽精微，至广大[D].湖南师范大学,传播学,2013,硕士.
[49]刘志涛.锆类气凝胶的制备、改性及性能研究[D].国防科学技术大学,材料科学与工程,2012,硕士.
[50]乔华.波动性高糖对人脐静脉血管内皮细胞的损伤及别嘌呤醇干预的研究[D].扬州大学,内科学,2011,硕士.